摘要：由于傳統(tǒng)方法在檢測(cè)水中大腸菌群和大腸埃希氏菌需要48小時(shí)左右,且操作過程復(fù)雜,難以掌握。現(xiàn)介紹一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，根據(jù)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5750-2006）中推薦的固定底物技術(shù)酶底物法可購(gòu)買到市售化產(chǎn)品西安海研生物科技有限公司的Colitech試劑。用于檢測(cè)100ml水樣，只需手工操作2分鐘，即可在24小時(shí)內(nèi)同時(shí)定量檢測(cè)出大腸菌群和大腸埃希氏菌。此方法大大的減少了工作量，避免了使用多管法的逐級(jí)稀釋帶來(lái)的操作誤差；也避免了使用濾膜法時(shí)肉眼讀數(shù)的人為誤差，所以其假陽(yáng)性率和假陰性率都比傳統(tǒng)方法低。由于24小時(shí)內(nèi)就得到結(jié)果，可以很好的用于突發(fā)事件應(yīng)急。

1. 背景：

目前我國(guó)對(duì)生活飲用水、水源水、地表水等進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)，檢測(cè)的指標(biāo)為大腸菌群和大腸埃希氏菌或糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），以這些指標(biāo)作為糞便污染的指示菌。采用的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為膜過濾法和多管發(fā)酵法。但這兩種方法檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，需48—72小時(shí)，需驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)步驟較為繁瑣，所以不能對(duì)水的衛(wèi)生學(xué)狀況做出快速評(píng)價(jià)。因此，采用快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法很必要。固定地物技術(shù)酶底物法可以較好的彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。

主要內(nèi)容：

1、實(shí)驗(yàn)原理

2、儀器設(shè)備與試劑耗材

3、實(shí)驗(yàn)步驟

4、討論與分析

2. 原理：

固定底物技術(shù)酶底物法（Defined Substrate Technology）采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長(zhǎng)366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理，來(lái)判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。固定底物技術(shù)酶底物法可以選用國(guó)標(biāo)中推薦粉狀培養(yǎng)基（西安立科公司的酶底物試劑）來(lái)進(jìn)行簡(jiǎn)便的操作；無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)；固定底物技術(shù)酶底物法檢測(cè)時(shí)間短，只需24小時(shí)即可同時(shí)定量出水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值。

3. 試劑和設(shè)備：

3.1 試劑：采用固定底物技術(shù)酶底物法市售化的MMO-MUG（Minimum Media ONPG-MUG）培養(yǎng)基—酶底物試劑。

3.2 耗材：取樣瓶或使用滅菌的玻璃；51孔定量盤或97孔定量盤。

注：51孔定量盤可在無(wú)需稀釋的情況下檢測(cè)1—200個(gè)目標(biāo)菌/100ml水樣；97孔定量盤可在無(wú)需稀釋的情況下檢測(cè)1—2419個(gè)目標(biāo)菌/100ml水樣。

3.3 設(shè)備：定量程控封口機(jī)；366nm紫外燈；陽(yáng)性對(duì)照物 。

注：海研sea plus定量程控封口機(jī)除了將定量盤進(jìn)行封口外還對(duì)100ml水樣平均分配到51個(gè)孔或者是97個(gè)孔中。

4. 操作方法：

4.1 定性檢測(cè)：

4.1.1 適用范圍：

一般用于檢測(cè)飲用水、瓶裝水等；這些水樣的結(jié)果是不得檢出。所以只需用定性檢測(cè)就可滿足試驗(yàn)要求。

4.1.2 操作步驟：

1) 將一個(gè)酶底物試劑倒入裝有100ml水樣的無(wú)菌取樣瓶或無(wú)菌玻璃瓶中，混勻。

2) 放在36±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)；

注：如檢測(cè)耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）則需放在44.5℃，培養(yǎng)24小時(shí)；如果培養(yǎng)時(shí)間超過28小時(shí)，則陰性結(jié)果則結(jié)果有效，如果為陽(yáng)性結(jié)果則結(jié)果無(wú)效，需重做此水樣。

3) 根據(jù)下面的結(jié)果解釋讀取結(jié)果

4) 無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)

4.2 定量檢測(cè)

4.2.1 適用范圍：適用于任何一種水體。

4.2.2 操作步驟：

1) 將一個(gè)酶底物試劑倒入裝有100ml水樣的無(wú)菌取樣瓶或無(wú)菌玻璃瓶中，混勻。

2) 將瓶?jī)?nèi)的水樣全部倒入51孔或者是97孔定量盤中，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后使用定量程控封口機(jī)進(jìn)行封口。

3) 將定量盤放在36±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí) 。

注：如檢測(cè)耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）則需放在44.5℃，培養(yǎng)24小時(shí)；如果培養(yǎng)時(shí)間超過28小時(shí)，則陰性結(jié)果則結(jié)果有效，如果為陽(yáng)性結(jié)果則結(jié)果無(wú)效，需重做此水樣。

4) 根據(jù)下面的結(jié)果解釋讀取結(jié)果。數(shù)出陽(yáng)性格子數(shù)后對(duì)照MPN表得到結(jié)果。

5) 無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)

5. 測(cè)量范圍

5.1 最低檢出限酶底物試劑可以在24小時(shí)同時(shí)檢測(cè)出總大腸菌群和大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群（糞大腸菌群），它可以在100ml水樣中抑制2百萬(wàn)個(gè)雜菌干擾，最低檢出限為每100ml水樣可檢測(cè)出1cfu的總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。

5.2 選用51孔定量盤

在不稀釋的情況下，100ml水樣可檢測(cè)200個(gè)總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。

5.3 選用97孔定量盤

在不稀釋的情況下，100ml水樣可檢測(cè)2419個(gè)總大腸菌群，大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）。

6 檢測(cè)水樣的范圍

飲用水 、源水 、瓶裝水 、中水 、二次供水 、管網(wǎng)水 、廢水 、食品水 、畜牧用水 、醫(yī)療用水

7．實(shí)驗(yàn)過程中需注意的地方

如果樣品有背景顏色，請(qǐng)做一個(gè)空白實(shí)驗(yàn)，與結(jié)果相比較，如果樣品被稀釋，則在讀取MPN表時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，只可使用純水，不含緩沖的水，不含氧化劑的水進(jìn)行樣品稀釋，如果樣品中含有過多的氯，則在加入試劑時(shí)會(huì)顯藍(lán)光，此時(shí)樣品應(yīng)被終止檢測(cè)。

8．結(jié)論

總大腸菌群細(xì)菌主要由以下4個(gè)菌屬細(xì)菌組成：埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，有的也可以在營(yíng)養(yǎng)豐富的水體中檢出，即非糞便污染的情況下，也有檢出這些細(xì)菌的可能性。糞大腸菌群組成與總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個(gè)種，即大腸埃希氏菌；檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數(shù)量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義很大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些， 固定底物技術(shù)酶底物法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，可在24小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況且無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)；減少了傳統(tǒng)方法中人為操作的誤差，能夠更準(zhǔn)地判斷水樣的微生物污染狀況；作為飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的新方法，不但可以用于水樣的例行檢測(cè)，更可作為應(yīng)急突發(fā)事件的必備試劑。